Replikation und Reparaturmechanismen der DNA

Bei der Zellteilung muss die gesamte DNA verdoppelt werden, damit aus einer Zelle zwei Tochterzellen mit identischem genetischem Material entstehen. Die Verdopplung der DNA (DNA-Replikation) erfordert, dass die Doppelhelixstruktur der DNA lokal aufgelöst wird. An jedem Einzelstrang können dann spezifische Proteine (u.a. DNA-Polymerasen) einen komplementären Tochterstrang synthetisieren. Es entstehen zwei Doppelstränge, die jeweils aus einem alten und einem neuen Strang zusammengesetzt sind.

Die DNA liegt im Zellkern an Proteine gebunden vor und ist sehr dicht gepackt. Für die Replikation, aber auch zum Ablesen der Gene, wird diese Verpackung zeitweise aufgelockert. Dieser Prozess ist streng reguliert.

Die DNA-Replikation beinhaltet zwar Kontrollmechanismen, um die genetische Information möglichst stabil zu halten, aber dennoch passieren Fehler. So werden z.B. falsche Basen eingebaut. Äußere Einflüsse sowie Vorgänge im Inneren der Zelle führen zu Veränderungen in der chemischen Struktur der DNA. Es ist also wichtig, dass Reparaturmechanismen existieren, die für ein ausreichendes Maß an Stabilität des Genoms sorgen. Fehlerhaft gepaarte Basen werden von spezialisierten Enzymen herausgeschnitten und ersetzt. So können sogar Brüche des Doppelstrangs z.T. fehlerfrei repariert werden. Wird ein DNA-Schaden nicht repariert, kommt es zu einer Mutation im Genom.

Vor jeder Zellteilung muss der vollständige Chromosomensatz des Zellkerns exakt verdoppelt werden. Diesen Vorgang bezeichnet man als DNA-Replikation, bei der zwei identische Schwesterchromatiden jedes Chromosoms entstehen. Die Bausteine für die DNA-Synthese (ebenso wie für die RNA-Synthese) sind Nukleosidtriphosphate. Die Energie für die Synthese stammt aus der Spaltung der Phosphorsäureanhydridbindung zwischen α- und β-Phosphatgruppe dieser Nukleotide.

• Definition: Herstellung einer Kopie eines DNA-Doppelstrangs während der Zellteilung (in der S-Phase des Zellzyklus)
• Ziel: Nach der Zellteilung enthält jede Tochterzelle die identische genetische Information
• Eigenschaften des Replikationsmechanismus
  • Semikonservativ
    • Der DNA-Doppelstrang wird in zwei Einzelstränge aufgespalten (Bildung einer Replikationsgabel)
    • Jeder Einzelstrang dient als Matrize für die Synthese eines komplementären neuen Strangs
    • Das Ergebnis der Replikation sind zwei identische doppelsträngige DNA-Moleküle, die jeweils aus einem alten (Elternstrang) und einem neu synthetisierten Tochterstrang bestehen
  • Bidirektional
    • Die Replikation geht in zwei Richtungen
    • An der Stelle, an der der DNA-Doppelstrang auseinandergewunden wird, bilden sich zwei "aktive" Replikationsgabeln

Die Richtung der DNA-Replikation verläuft von 5'→3'. Das bedeutet, dass an einen bereits vorhandenen Einzelstrang mit einer freien 3'OH-Gruppe das nächste Nukleotid angehängt wird!

Die DNA-Replikation gliedert sich in drei Phasen: Die Initiation, die Elongation und die Termination . Es sind eine Vielzahl verschiedener Enzyme beteiligt.

An der DNA-Replikation beteiligte Proteine

Gyrasehemmer
Gyrasehemmer sind Hemmstoffe der bakteriellen Topoisomerase II. Sie inhibieren sowohl die Initiation der DNA-Synthese als auch nach der Termination die Aufteilung der beiden Tochterchromosomen auf die zwei neuen Zellen. Daher werden sie als Antibiotika eingesetzt (z.B. Ciprofloxacin, Nalidixinsäure).

1. Initiation

• Definition: Beginn der DNA-Replikation
• Beteiligte Enzyme: U.a. Helikase, Topoisomerasen, Einzelstrang-bindende Proteine
• Ablauf
  1. Spezifische Proteine erkennen und binden am „ori“ (Origin of Replication, Replikationsursprung), einem speziellen DNA-Abschnitt im Genom
  2. Eine Helikase beginnt am ori mit der ATP-abhängigen Auftrennung der doppelsträngigen DNA in Einzelstränge
  3. Topoisomerasen entwinden die DNA und verändern ihre räumliche Struktur (die sog. Topologie)
     • Topoisomerase I
       • Spaltet einen der beiden DNA-Stränge
       • Benötigt kein ATP
     • Topoisomerase II
       • Spaltet vorübergehend beide DNA-Stränge für größere strukturelle Veränderungen der DNA
       • Benötigt ATP
  4. Das Replication Protein A (RPA) bindet an den Einzelstrang und verhindert, dass sich die beiden Einzelstränge wieder verbinden

2. Elongation

• Definition: DNA-Synthese-Phase
• Beteiligte Proteine: U.a. Primase, DNA-Polymerase , Ligase
  • Replisom: Komplex am ori aus DNA-Polymerase und anderen Proteinen, der mit der Replikationsgabel wandert
  • Gleitring (Clamp): Untereinheit der DNA-Polymerase, die für die Verankerung der DNA-Polymerase auf der DNA verantwortlich ist, indem sie diese umklammert
• Ablauf
  1. Primersynthese
     • Primer: Kurzes, 5–10 Nukleotide langes RNA-Stück, das von einer Primase (DNA-abhängigen RNA-Polymerase) komplementär zum Matrizenstrang synthetisiert wird
  2. DNA-Synthese
     • Synthesemechanismus
       • Prinzip: Anknüpfen des nächsten zum Matrizenstrang komplementären Desoxynukleotids (dATP, dGTP, dCTP oder dTTP) an die freie 3'OH-Gruppe des zu verlängernden DNA-Strangs (Bildung einer Esterbindung!)
       • Details
         1. DNA-Polymerase knüpft die Esterbindung: Sie katalysiert den nukleophilen Angriff der 3'OH-Gruppe auf das α-Phosphat des anzuknüpfenden Desoxyribonukleosidtriphosphats
         2. Einzelstrang wird um ein Nukleotid verlängert
         3. Pyrophosphat (PP_i) wird freigesetzt
         4. Pyrophosphat wird dann von einer Pyrophosphatase in zwei Phosphate gespalten
       • Konsequenz aus Mechanismus und Richtung der Synthese sowie DNA-Struktur
         • Die DNA-Replikation erfolgt nur an dem Einzelstrang kontinuierlich, der ein freies 3'OH-Ende hat (Leitstrang, „leading strand“)
           • Für den Leitstrang wird nur ein Primer benötigt
         • Am anderen Einzelstrang (Folgestrang, „lagging strand“) verläuft die Polymerisation ebenfalls in 5'→3'-Richtung!
         • Okazaki-Fragmente: Damit die Replikation an beiden Strängen gleichzeitig ablaufen kann, wird der Folgestrang diskontinuierlich, d.h. in Abschnitten synthetisiert
           • Für jeden dieser DNA-Abschnitte wird ein jeweiliger Primer benötigt
           • Der Primer wird jeweils an der Replikationsgabel synthetisiert
  3. Proofreading (Korrekturlesen): Manche Polymerasen besitzen eine 3'→5'-Exonukleaseaktivität und entfernen falsch gepaarte Nukleotide
  4. Entfernen der Primer: Die Aktivität der RNase H und eine 5'→3'-Exonukleaseaktivität der prokaryotischen DNA-Polymerase I bzw. das Enzym FEN-1 (Flap Endonuclease 1) bei Eukaryoten sind notwendig, um die RNA-Primer vollständig zu entfernen
  5. Auffüllen der Lücken: DNA-Polymerase füllt die Lücken mit zum Elternstrang komplementären Nukleotiden auf, bis die freien Enden aufeinanderstoßen
  6. Verbinden der Enden
     • Eine Ligase verbindet (ligiert) die freien Enden des neu synthetisierten Tochterstrangs
     • Ligasereaktion
       1. Die Ligase überträgt einen AMP-Rest auf das 5'-Phosphatende des einen der zu verbindenden DNA-Fragmente
       2. AMP wird abgespalten und das 5'-Phosphatende mit dem 3'OH-Ende des anderen Fragments verbunden

Die Topoisomerase I spaltet einen DNA-Strang und benötigt dazu kein ATP, die Topoisomerase II spaltet beide DNA-Stränge und benötigt dafür ATP!

Bei der DNA-Synthese kommt es zu einem nukleophilen Angriff der 3'OH-Gruppe des bestehenden DNA-Strangs auf das α-Phosphat des anzuknüpfenden Desoxyribonukleosidtriphosphats!

3. Termination

• Definition: Beendigung der DNA-Replikation, wenn zwei Replikationsblasen aufeinander treffen. Für zirkuläre und lineare DNA-Moleküle gibt es verschiedene Terminationsmechanismen
• Mechanismus: Stopp der Replikation wird ausgelöst, indem Terminationsproteine an sog. Terminationssequenzen binden

Telomere sind die Enden der linearen menschlichen Chromosomen. Sie kodieren nicht für Strukturgene, sondern schützen vor deren Verlust. Mit jeder Zellteilung nimmt jedoch in somatischen Zellen die Telomerlänge ab, wodurch diese Zellen eine limitierte Lebensspanne haben. Die Telomere werden deshalb mit dem Prozess der Zellalterung in Zusammenhang gebracht.

• Definition: Nicht-kodierende DNA-Abschnitte aus einigen 1.000 Basenpaaren an den Enden von linearen Chromosomen, die bei Menschen aus Sequenzwiederholungen von sechs Nukleotiden bestehen
• Funktion: Verhindern den Verlust von Strukturgenen während der Replikation linearer DNA-Doppelstränge
  • Der Leitstrang kann komplett synthetisiert werden
  • Das 5'-Ende des Folgestrangs wird kürzer
• Telomerase
  • Synthetisiert DNA nach Vorlage einer RNA
  • Spezielle DNA-Polymerase mit eigener RNA-Matrize (Ribonukleoprotein), die in sich häufig teilenden Zellen (z.B. einem Großteil der Tumorzellen) vorkommt und die Telomere verlängern kann
  • Reverse Transkriptase: Sie verlängert das 3'-Ende des Elternstrangs, sodass sich das 5'-Ende bei der Replikation nicht verkürzt

Bei der DNA-Replikation treten Fehler auf. Des Weiteren ist die DNA chemisch nicht komplett stabil: Einige Bindungen sind anfällig für spontane Veränderungen. Hinzu kommen DNA-Schäden durch Einwirkungen von außen (chemische oder physikalische Noxen). Das alles können Ursachen für Mutationen sein, d.h. Veränderungen im Genom einer Zelle. Die gespeicherte genetische Information wird geändert, wodurch ein veränderter Phänotyp entstehen kann. Für das Individuum sind Mutationen unerwünscht und werden repariert, wenn möglich. Mutationen sind aber andererseits auch die Grundlage für Evolution. Sie ermöglichen einer Population eine bessere Anpassung an äußere Umstände, wenn dadurch angepasstere Individuen entstehen.

Endogene Ursachen für Fehler in der DNA-Sequenz

• Replikationsfehler
  • Repetitive Sequenzen: Die DNA-Polymerase ist fehleranfällig beim Ablesen repetitiver DNA-Sequenzen. Insb. bei sog. Triplett-Repeats kommt es vor, dass der repetitive Bereich mehrfach abgelesen wird
  • Keto-Enol-Tautomerie: Die sehr selten vorliegende Enol-Form des Thymins paart mit Guanin statt mit Adenin
• Chemische Instabilität
  • Depurinierung: Thermische Spaltung der N-glykosidischen Bindung zwischen Desoxyribose und Purinbase schon bei Körpertemperatur
    • Es entsteht eine AP-Stelle (allgemeine Bezeichnung für eine apurinische, aber auch eine apyrimidinische Stelle)
    • AP-Stellen gehören zu den häufigsten physiologisch vorkommenden DNA-Läsionen (man schätzt ihre Zahl auf >10.000 pro Tag und pro Zelle in Eukaryoten)
  • Schädigung durch Radikale: Bspw. hochreaktive Sauerstoff- oder Hydroxylradikale, die oxidativen Stress bewirken
    • Beispiel: Guanosin → 8-Oxo-Guanosin
      • Folge: Bei der Replikation paart 8-Oxo-Guanosin mit Adenin statt mit Cytosin
  • Spontane oxidative Desaminierung
    • Beispiele
      • Desaminierung von 5-Methylcytosin zu Thymin
        • Folge: Bei der Replikation paart Thymin dann mit Adenin anstelle von 5-Methylcytosin mit Guanin
      • Desaminierung von Cytosin zu Uracil (z.B. infolge von Nitritaufnahme mit der Nahrung)
        • Folge
          • Normalerweise wird Uracil als falsch erkannt und durch Basenexzisionsreparatur wieder durch Cytosin ersetzt.
          • Geschieht das nicht, paart bei der nächsten Replikation Uracil mit Adenin anstelle von Cytosin mit Guanin

Chorea Huntington (Veitstanz)
Die Chorea Huntington ist eine Trinukleotid-Repeat-Erkrankung, bei der im Gen für das Protein Huntingtin die Nukleotidabfolge -CAG- weit über die durchschnittliche Anzahl (9 bis 35 Repeats des Tripletts) hinaus vermehrt ist. Nachweisen kann man die Genveränderung mittels PCR. Je länger die in der PCR replizierte DNA ist, desto mehr Tripletts liegen auch auf dem Gen. CAG kodiert für die Aminosäure Glutamin, die bei Erkrankten häufig hintereinander in das Protein eingebaut wird, sodass das Protein im Gehirn aggregiert. Die auffälligsten Symptome dieser neurologischen Erkrankung sind plötzliche, nicht willkürlich beeinflussbare Bewegungen z.B. der Finger (Klavierspielerbewegungen) und des Gesichts.

Exogene Ursachen für Fehler in der DNA-Sequenz

• Chemische Noxen
  • Alkylierende Substanzen
    • Chemische Verbindungen, die die DNA kovalent modifizieren, indem Basen alkyliert (methyliert oder ethyliert) werden, sodass sie mit anderen Basen paaren als üblich
      • Bspw. entsteht O⁶-Ethylguanin durch Alkylierung aus Guanin und paart mit Thymin statt mit Cytosin
    • Bspw. wirken viele Inhaltsstoffe des Tabakrauches auf diese Weise kanzerogen
    • Weitere Beispiele: Senfgas, Dimethylnitrosamin, Dimethylsulfat
  • Interkalierende Substanzen: Chemische Verbindungen, die sich zwischen die gestapelten Basen in die DNA einlagern
    • Konsequenz
      • Replikation stoppt
      • Risiko für Strangbrüche steigt
    • Beispiele: Ethidiumbromid, Acridinfarbstoffe, Actinomycin D
• Physikalische Noxen
  • UV-Strahlung
    • Energiereiche Strahlung, z.B. UVB-Strahlung, die dazu führen kann, dass benachbarte Pyrimidinbasen Dimere bilden
    • Meistens sind das Thymindimere, zwischen denen sich ein Cyclobutanring bildet
    • Die Replikation stoppt an dieser Stelle
  • Ionisierende Strahlung
    • Energiereiche Strahlung, die zu Einzel- und Doppelstrangbrüchen in der DNA führen kann
    • Außerdem kommt es zur verstärkten Bildung von Radikalen, z.B. Sauerstoff- und Hydroxylradikalen, die die Basen chemisch verändern können

Typische Ursachen von DNA-Schäden:
Desaminierung von Cytosin zu Uracil → Uracil paart dann mit Adenin!
UV-Strahlung → Thymindimere!
Ionisierende Strahlung → Radikalbildung → DNA-Schäden!

Trotz Fehler bei der DNA-Reparatur und DNA-Schäden durch endogene und exogene Noxen liegt die spontane Mutationsrate nur bei 1×10^-9, d.h. pro Zellteilung wird im Durchschnitt eine von 1 Milliarden Basen verändert. Der Grund dafür ist einerseits die Proofreading-Funktion einiger DNA-Polymerasen , durch die Fehler bei der DNA-Replikation in den überwiegenden Fällen direkt korrigiert werden. Andererseits gibt es spezifische DNA-Reparaturmechanismen, die dafür sorgen, dass die Basensequenz relativ stabil bleibt. Die Möglichkeiten der Zelle/des Organismus, DNA-Schäden zu reparieren, beruhen meist auf der Sequenzinformation aus dem intakten DNA-Strang.

Mismatch-Reparatur

Mismatch = Fehlpaarung der Basen, d.h. es wurde ein falsches Nukleotid eingebaut

• Definition: Das Mismatch-Reparatursystem behebt noch während der Replikation Fehler, die nicht durch die Proofreading-Funktion der Polymerase bei der DNA-Replikation behoben wurden
• Enzyme: MSH , MLH , Exonuklease I, DNA-Polymerase δ, DNA-Ligase (in E. coli: Erkennung der Fehlpaarung durch MutS und MutL, Endonuklease MutH)
• Mechanismus
  1. Erkennung der Fehlpaarung durch MSH-Proteine
  2. Schneiden des fehlerhaften DNA-Tochterstrangs durch MLH (Endonuklease)
  3. Entfernen der fehlerhaften Nukleotide durch Exonuklease
  4. Füllen der Lücke durch die Polymerase
  5. Verbinden der Enden durch die Ligase

Direkte Reparatur von Basen

• Definition: Reparatur beschädigter Base (nicht ihr Austausch)
• Mechanismus 1
  • Photolyase spaltet UV-Licht- und FADH-abhängig Thymindimere
  • Dieses Enzym kommt in Säugetierzellen nicht vor, sondern nur in manchen Bakterien und niedrigen Eukaryoten
• Mechanismus 2
  • O⁶-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase ist in der Lage, O⁶-Alkylguanine (O⁶-Methylguanin und O⁶-Ethylguanin) wieder in Guanin zu überführen
  • Das Enzym wird dadurch irreversibel inaktiviert

Basenexzisionsreparatur

• Definition: Entfernung desaminierter oder oxidierter Basen durch Ausschneiden des fehlerhaften Desoxyribonukleotids
• Enzyme: DNA-Glykosylase, AP-Endonuklease, Phosphodiesterase, DNA-Polymerase β, DNA-Ligase
• Mechanismus
  1. Erkennung der beschädigten Base durch DNA-Glykosylase und Entfernen der Base (durch Spaltung der N-glykosidischen Bindung zwischen Base und Desoxyribose) → AP-Stelle
  2. Entfernen des Desoxyribosephosphats durch AP-Endonuklease und Phosphodiesterase (durch Spaltung der Phosphodiesterbindungen, mit denen das Desoxyribonukleotid am 3'- und 5'-Ende ins DNA-Rückgrat eingebunden ist)
  3. Füllen der Lücke durch die Polymerase
  4. Verbinden der Enden durch die Ligase

Nukleotidexzisionsreparatur

• Definition: Reparatur von DNA-Schäden, die die Raumstruktur der DNA verändern (z.B. bei Bildung von Thymindimeren), durch Ausschneiden mehrerer Nukleotide
• Enzyme: Proteinkomplex zur Erkennung des DNA-Schadens, Transkriptionsfaktor TFIIH (Helikaseaktivität), Endonukleasen, DNA-Polymerase δ und ε, DNA-Ligase
• Mechanismus
  1. Erkennung der veränderten DNA-Struktur
  2. Auftrennung der doppelsträngigen DNA in Einzelstränge durch TFIIH (etwa über eine Sequenz von 25 Basenpaaren)
  3. Herausschneiden eines ca. 30 Basenpaare langen Oligonukleotids des fehlerhaften DNA-Tochterstrangs durch Endonukleasen
  4. Füllen der Lücke durch die Polymerase
  5. Verbinden der Enden durch die Ligase

Xeroderma pigmentosum
Bei dieser seltenen Hauterkrankung ist durch einen Defekt des Nukleotidexzisions-Reparatursystems die Haut extrem lichtempfindlich. Wenn das Sonnenlicht nicht komplett gemieden wird, kommt es zu Pigmentverschiebungen und schließlich zur Entstehung von Tumoren.

Reparatur von Doppelstrangbrüchen

• Definition: Reparatur von Brüchen beider DNA-Stränge, die die Stabilität des Genoms bedrohen, z.B. durch ionisierende Strahlung oder bei der Bildung von Radikalen im Zellstoffwechsel
• Voraussetzung: Bindung eines Proteinkomplexes an die freiliegenden Chromosomenenden → Aktivierung der Proteinkinase ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) → Aktivierung von p53 → Anhalten des Zellzyklus

BRCA1 und BRCA2
An der Reparatur von Doppelstrangbrüchen sind viele Proteine beteiligt. Für die homologe Rekombination wichtig sind u.a. die Proteine BRCA1 und BRCA2. Mutationen in den Genen für diese Proteine stehen in Verbindung mit einem deutlich erhöhten Risiko, an Brustkrebs zu erkranken.

Grundlagen der DNA-Replikation

Was versteht man unter DNA-Replikation und welche Prinzipien liegen ihr zugrunde?

Ablauf der DNA-Replikation

In welche Phasen kann die Replikation untergliedert werden?

An welcher Stelle im Genom beginnt die Replikation?

Welche Aufgabe hat das Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) während der DNA-Replikation?

Welches Enzym katalysiert bei der DNA-Replikation die Auftrennung des DNA-Doppelstrangs?

Was ist der Unterschied zwischen Topoisomerase I und II?

Beschreibe den DNA-Synthesemechanismus!

Was sind Okazaki-Fragmente?

Wie werden die bei Abschluss der DNA-Replikation fehlenden Esterbindungen im DNA-Rückgrat gebildet?

Telomere

Was sind Telomere?

Welche Funktion hat die Telomerase?

Mechanismen der DNA-Schädigung

Wie kann UV-Strahlung zu Schäden in der DNA-Sequenz führen?

Was passiert bei der oxidativen Desaminierung von Basen der DNA? Nenne Beispiele!

Mechanismen der DNA-Reparatur

Welche Aufgabe übernimmt die DNA-Glykosylase bei der Basenexzisionsreparatur?

Welcher Reparaturmechanismus setzt bei Pyrimidindimeren ein?

Eine Sammlung von allgemeineren und offeneren Fragen zu den verschiedenen prüfungsrelevanten Themen findest du im Kapitel Beispielfragen aus dem mündlichen Physikum.

Forever Young? - Kann die Telomerbiologie die Zellalterung aufhalten? (September 2020)

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DNA-Replikation

DNA-Reparaturmechanismen

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