Biochemische Labormethoden

In der medizinischen und biowissenschaftlichen Grundlagenforschung kommen verschiedenste Labormethoden zum Einsatz. Viele davon werden auch in der Diagnostik und Therapie von Erkrankungen angewendet, z.B. zum Erregernachweis, zur Genotypenbestimmung oder zur rekombinanten Herstellung therapeutischer Proteine. Eine wichtige Methode der Molekularbiologie ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Sie dient der einfachen und sehr spezifischen Vervielfältigung von Abschnitten doppelsträngiger DNA. Dadurch lassen sich z.B. bei Infektionen Bakterien in Patientenmaterial nachweisen. Ein anderes Beispiel für die Anwendung von Methoden der molekularen Genetik ist die Sequenzanalyse bestimmter Gene: Hier kann bei Verdacht auf das Vorliegen einer erblichen Erkrankung das Genom eines Patienten untersucht und eventuell eine Mutation nachgewiesen werden. Das kann u.U. eine verbesserte Therapie ermöglichen oder das Erkrankungsrisiko einschätzbar machen. Schließlich lassen sich über Klonierung und Überexpression verschiedener therapeutisch wirksamer Proteine in Wirtszellen diese Proteine in großen Mengen aufreinigen. Zum Beispiel kann dadurch rekombinantes Interferon-β zur Therapie der multiplen Sklerose hergestellt werden.

Die Molekularbiologie beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der Biologie. Dabei geht es insbesondere um den Fluss der genetischen Information von der DNA zur RNA und zu Proteinen. Die Erkenntnisse über die zellulären Abläufe, die hinter diesem Informationsfluss stehen, finden in den molekularbiologischen Labormethoden ihre Anwendung. Z.B. werden Enzyme, die für die DNA-Replikation in der Zelle verantwortlich sind, im Labor verwendet, um DNA zu synthetisieren.

Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR)

• Definition: Methode zur Amplifikation (Vervielfältigung) spezifischer DNA-Abschnitte aus sehr kleinen Mengen Ausgangs-DNA, z.B. zur nachfolgenden Sequenzierung oder zur Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks
• Prinzip: Zyklische Vervielfältigung eines Abschnitts doppelsträngiger DNA zwischen zwei Oligonukleotid-Primern mit Hilfe einer thermostabilen Polymerase
• Benötigte Materialien
  • Hitzestabile DNA-Polymerase (z.B. Taq oder Pfu)
  • Zwei sequenzspezifische Primer (einzelsträngige DNA, ca. 15-25 Desoxyribonukleotide lang, komplementär zu jeweils einem Ende des zu amplifizierenden DNA-Bereichs)
  • DNA-Template
  • dNTPs (Desoxyribonukleotide, dATP, dGTP, dCTP und dTTP)
  • MgCl₂
  • Pufferlösung
• Amplifikationszyklen (ca. 20 bis 50 Wiederholungen)
  • Denaturierung
    • Doppelsträngige DNA wird durch Erhöhung der Temperatur auf ca. 95°C in Einzelstränge getrennt.
  • Annealing (Hybridisierung)
    • Primer binden an komplementäre DNA-Sequenz.
    • Temperatur ca. 50-60°C
  • Elongation (DNA-Synthese)
    • DNA-Polymerase verlängert die Primer an deren 3'OH-Ende, sodass wieder doppelsträngige DNA entsteht.
    • Temperatur ca. 70°C
• Ergebnis: Vervielfältigung der DNA-Sequenz in Abhängigkeit von der Zahl der Amplifikationszyklen und der Effizienz der Reaktion ca. um den Faktor 10⁶ bis 10¹²
• Analyse: Nachweis der amplifizierten DNA-Sequenz durch Gelelektrophorese
• Reverse-Transkriptase-PCR: Nachweis von RNA (z.B. aus RNA-Viren) mittels reverser Transkriptase
  • RNA wird in DNA umgeschrieben (sog. cDNA, von engl. complementary DNA = "komplementäre DNA") und dann mittels Standard-PCR amplifiziert

Um einen Abschnitt einer doppelsträngigen DNA per PCR zu amplifizieren, benötigt man zwei spezifische Primer. Nach der Denaturierung der DNA bindet jeder Primer an einen der beiden DNA-Stränge (Annealing) und wird durch die thermostabile Polymerase an seinem 3'-Ende verlängert (Elongation). Diese drei Schritte werden ca. 30 mal wiederholt.

DNA-Sequenzierung nach Sanger (Kettenabbruchmethode, Didesoxymethode)

• Definition: Entschlüsselung der Basenabfolge eines DNA-Moleküls auf der Basis der in-vitro-Replikation
• Prinzip
  • Ein Teil der DNA-Sequenz muss bekannt sein. Für diese werden komplementäre Primer (Oligodesoxynukleotide) synthetisiert.
  • Vier gleiche Reaktionsansätze mit folgendem Inhalt:
    • Zu sequenzierendes DNA-Molekül
    • DNA-Polymerase
    • Primer
    • dNTPs (Desoxyribonukleotide, dATP, dGTP, dCTP und dTTP)
    • Puffer (mit MgCl₂)
    • ddNTPs: Je ein 2'-3'-Didesoxynukleotid (ddATP, ddGTP, ddCTP oder ddTTP) in geringer Konzentration
  • Die Polymerase verlängert in jedem Ansatz die Primer wie in der DNA-Replikation, aber die Verlängerung des komplementären DNA-Strangs bricht beim Einbau eines 2'-3'-Didesoxynukleotids ab. Durch das Fehlen der 3'OH-Gruppe kann kein neues dNTP angehängt werden.
  • Dadurch, dass nur geringe Konzentrationen an 2'-3'-Didesoxynukleotiden vorhanden sind, erhält man statistisch verteilt verschieden lange DNA-Ketten.
  • Analyse per Gelelektrophorese
• Durch die Verwendung unterschiedlich fluoreszenzmarkierter ddNTPs lässt sich die Sequenzierung in nur einem Ansatz durchführen.

Hybridisierungstechniken in der Molekularbiologie

Verschiedene Methoden nutzen die Hybridisierung, d.h. die spezifische Anlagerung komplementärer DNA- oder RNA-Fragmente über Basenpaarung, zum Nachweis von DNA- oder RNA-Molekülen.

• Southern Blot: Nachweis von DNA-Fragmenten durch Übertragung der DNA von einem Elektrophorese-Gel auf eine Membran (aus Nylon oder Nitrocellulose) und Detektion über eine markierte Oligonukleotid-Sonde
• Northern Blot: Nachweis von RNA-Fragmenten analog zum Southern Blot
• DNA-Microarray: Nachweis spezifischer Nukleotidsequenzen im Hochdurchsatzverfahren

Genom-Editierung (Genome Editing)

• Definition: Gezielte Veränderung des Genoms lebender Organismen an einer oder mehreren spezifischen Stellen mittels Endonukleasen
• Ziel: Ausschalten eines Gens durch Mutation oder Entfernen (Deletion, Gen-Knockout) und ggf. Einfügen bestimmter DNA-Sequenzen (Insertion, Gen-Knockin)

Werkzeuge

• CRISPR/Cas
  • Definition
    • CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic Repeats): Nukleinsäuresequenz im Genom von Prokaryoten, die einer adaptiven Immunantwort dient
    • Cas(CRISPR-associated)-Protein: Endonuklease (z.B. Cas9, Cas12a)
  • Hintergrund: Schutzmechanismus von Prokaryoten bei Infektion durch Phagen
    • Erstinfektion durch Phagen: Integration viraler Sequenz in die CRISPR-Region des bakteriellen Genoms
    • Transkription der CRISPR-Region und Komplexbildung der entstandenen RNA mit dem Cas-Protein
    • Nach erneuter Infektion: Bindung viraler Sequenz durch das komplementäre CRISPR-Transkript und Spaltung der viralen Sequenz durch das Cas-Protein
  • Anwendungsprinzip
    • Einschleusen von Cas-Protein und spezifischer RNA in die Zielzelle
    • Bindung an Zielsequenz und Induktion eines Doppelstrangbruchs
    • Zelleigene Reparatur durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder homologe Rekombination (HDR) bei Zugabe linearer DNA als Vorlage
  • Vorteile: Sehr präzise, kostengünstig, simultanes Schneiden verschiedener Sequenzen in einer Zelle möglich
  • Ausblick: Therapie onkologischer oder genetischer Erkrankungen
• Weitere, aufwendigere und unspezifischere Verfahren für induzierten Strangbruch: Zinkfingernukleasen, TALEN (Transcription Activator-like Effector Nuclease)

Klonierung

• Definition: Einbau eines DNA-Abschnitts in einen Vektor, wodurch dieser DNA-Abschnitt in eine Wirtszelle eingebracht und dort exprimiert werden kann
• Ziel: Vermehrung eines exogenen DNA-Abschnitts, bzw. Expression des Fremdgens in der Wirtszelle
• Werkzeuge
  • Plasmid/Klonierungsvektor
  • Zu vermehrende/exprimierende DNA, z.B. im Labor synthetisiert oder aus einem Spenderorganismus aufgereinigt
  • Restriktionsenzyme, z.B. Eco RI
  • DNA-Ligase
  • Wirtszellen (z.B. Bakterien wie E.coli oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae)
• Vorgehen
  1. Restriktionsverdau: Schneiden von Plasmid und dem einzubauenden DNA-Abschnitt mit dem gleichen Restriktionsenzym
     • Ergebnis: Zusammenpassende Enden von Plasmid und einzubauender DNA
  2. Ligation: Verknüpfung von geschnittenem Plasmid und einzubauender DNA mit Hilfe von DNA-Ligasen
  3. DNA-Transfer in Wirtszellen
     • Bei Bakterien: Transformation oder Transduktion
     • Bei Eukaryoten: Transfektion (= Einbringen von DNA oder RNA in eine Wirtszelle z.B. durch Elektroporation, chemische Reagenzien oder Viren)
  4. Ausplattieren, z.B. der Bakterienlösung auf Agarplatten und Inkubation unter Selektionsbedingungen, z.B. in Anwesenheit des Antibiotikums Ampicillin
  5. Selektion und Vermehrung mehrerer Klone (z.B. entspricht jede Bakterienkolonie auf der Agarplatte einem Klon) in einem Nährmedium unter Selektionsbedingungen
  6. Aufreinigung des vermehrten Plasmids (aus einem Klon) aus der Bakterienkultur, z.B. direkt als Genombibliothek oder zur Herstellung rekombinanter Proteine in geeigneten Wirtsorganismen

Herstellung therapeutischer Proteine in Wirtsorganismen

Viele therapeutisch eingesetzte Proteine werden gentechnisch in Bakterien hergestellt. Beispiele dafür sind das Wachstumshormon, Insulin, Impfstoffe gegen Hepatitis A und B, therapeutische Antikörper sowie Interferone.

• Prinzip
  • Klonierung des zu exprimierenden Gens in einen geeigneten Vektor
  • Transfer des Vektors mit dem zu exprimierenden Gen in einen Wirtsorganismus, z.B. E. coli
  • Zellkultur: Vermehrung des Wirtsorganismus in einem Nährmedium unter Selektionsbedingungen, z.B. Anwesenheit von Ampicillin, und Expression des Zielgens (Proteinbiosynthese)
  • Aufreinigung des hergestellten Proteins (s. Proteinanalytik), z.B. über einen Affinitäts-Tag
• Voraussetzungen (Wahl des Wirtsorganismus)
  • Glykosylierungen können nicht in E. coli hergestellt werden. Sind diese für die Proteinfunktion notwendig, muss auf eukaryotische Zellen als Expressionssystem umgestiegen werden.
  • Zur Expression in E. coli muss auf dem Expressionsplasmid ein bakterieller Promotor vorhanden sein, um die Transkription zu starten. Zudem darf das entsprechende Gen keine Introns tragen, da diese in Bakterien nicht gespleißt werden können. Stattdessen verwendet man cDNA (mittels reverser Transkriptase aus gespleißter mRNA hergestellte DNA) oder synthetische DNA-Sequenzen.
  • In E. coli werden z.T. andere Codons verwendet als in eukaryotischen Zellen. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann die Basensequenz des zu exprimierenden Gens dahingehend optimiert werden, dass eine effizientere Proteinsynthese des eukaryotischen Proteins in einem Prokaryoten stattfindet.
• Vorteile gegenüber der Gewinnung aus tierischem oder menschlichem Gewebe
  • Herstellung wesentlich größerer Mengen z.B. des Wachstumshormons TSH (Thyreoidea-stimulierendes-Hormon)
  • Senkung des Allergierisikos, z.B. durch rekombinant hergestelltes Humaninsulin gegenüber Rinderinsulin
  • Keine Übertragung von Infektionen, wie sie z.B. bei der Isolierung von Gerinnungsfaktoren aus Blutkonserven vorkommen kann
  • Herstellung optimierter Proteine, die stärker oder weniger stark wirken als ihre physiologischen Gegenstücke, z.B. sog. schnellwirksame, gentechnisch veränderte Insuline

Unter Proteinanalytik versteht man die biochemischen Methoden zur Charakterisierung der Struktur und Funktion von Proteinen. Dies spielt sowohl in der Forschung als auch in der Klinik eine Rolle (siehe auch: Kapitel Proteinanalytik).

Isolierung von Proteinen

Proteine lassen sich in zwei Schritten isolieren:

1. Freisetzung der Proteine aus den Zellen
   1. Zerstörung der Zellmembran (Zellaufschluss)
   2. Zentrifugation der Zellbestandteile
   3. Wenn nötig: Bestimmung der Fraktion, die die größte Konzentration des gesuchten Proteins enthält
2. Auftrennung und Reinigung des Proteingemischs
   • Verwendet werden z.B.
     • Affinitätschromatografie: Auftrennung nach spezifischen Bindungsaffinitäten
     • Immunpräzipitation: Auftrennung nach Bindungsaffinitäten zu spezifischen Antikörpern
       • Es bilden sich sog. Immunpräzipitate, d.h. das zu reinigende Protein wird durch einen spezifischen Antikörper gebunden und sedimentiert. Die Antikörper-Moleküle sind an magnetische oder Agarose-Kügelchen (sog. beads) gekoppelt und lassen sich vom restlichen Proteingemisch durch Magnetwirkung oder Zentrifugation abtrennen.
     • Gelfiltration/Größenausschluss-Chromatografie: Auftrennung nach Molekülgröße durch Diffusion durch ein sogenanntes Molekularsieb
     • Ionenaustausch-Chromatografie: Auftrennung nach Nettoladung
     • Aussalzen: Löslichkeit der Proteine wird durch Zugabe von Salz zum Lösungsmittel beeinflusst, ab einer bestimmten Salzkonzentration fallen sie aus

Bestimmung von Proteinkonzentration und Molekulargewicht

Bei der Analyse von Proteinen gibt es einige Parameter, die von besonderem Interesse sind: Das Molekulargewicht eines Proteins im Allgemeinen, sowie die Konzentration eines Proteins oder Proteingemischs in einer bestimmten Lösung. Um diese Parameter zu bestimmen, gibt es viele Methoden, von denen hier nur zwei exemplarisch ausgewählt wurden.

• Biuretreaktion:
  • Nachweis von Peptidbindungen, diese reagieren in alkalischer Lösung mit Cu²⁺-Ionen zu einem blauen Farbkomplex
  • Die Intensität der Färbung ist proportional zur Konzentration des Proteins
• SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)
  1. Zugabe von SDS (sodium dodecyl sulfate, Natriumdodecylsulfat) zum Proteingemisch, dies führt zur Entfaltung (Denaturierung) der Proteine
  2. Denaturierte Proteine enthalten durch die SDS-Bindung negative Ladungen proportional zu ihrer Molekülgröße
  3. Die Proteine wandern durch das als Molekularsieb (ähnlich wie oben) wirkende Polyacrylamidgel zur Anode und trennen sich entsprechend ihrer Größe auf
  4. Anfärben der Proteine zum Sichtbarmachen
  5. Durch den Vergleich mit einem gleichzeitig aufgetrennten Gemisch standardisierter Markerproteine ist eine Abschätzung des Molekulargewichts der Proteine möglich

Serumelektrophorese
Die SDS-PAGE wird in der Klinik labordiagnostisch genutzt, um die Serumproteine nach Fraktionen aufzutrennen und zu quantifizieren. Veränderungen der relativen Proteinfraktionen können zur Diagnostik verschiedener Erkrankungen herangezogen werden. Zum Beispiel ist die Albuminfraktion, die normalerweise den größten Anteil am Gesamtprotein hat, bei einer verminderten Syntheseleistung der Leber, wie sie bei der Leberzirrhose vorkommt, reduziert.

Spezifischer Nachweis von Proteinen

Bekannte Proteine können auf verschiedene Weisen nachgewiesen werden. Sehr häufig werden dafür immunologische Methoden verwendet. Neben dem Nachweis spezifischer Proteine existieren auch verschiedene Färbemethoden, mit denen Proteine in Gelen und/oder auf Membranen unspezifisch angefärbt werden können (z.B. Coomassie-, Silber- oder Ponceau-S-Färbung).

• Western Blot (Immunoblot)
  • Prinzip: Übertragung von Proteinen von einem Elektrophoresegel auf eine Membran (aus Nylon oder Nitrocellulose) durch eine senkrecht zum Gel angelegte elektrische Spannung
  • Ergebnis: Die im Gel nach ihrer Größe aufgetrennten Proteine befinden sich auf der Membran, wobei das in der Elektrophorese erzeugte Bandenmuster erhalten bleibt.
  • Detektion: Die Proteine werden durch spezifische Antikörper nachgewiesen.
    • Vorgehen
      1. Die Membran mit den übertragenen Proteinen wird in Puffer-Lösung gewaschen. Dadurch wird das SDS entfernt und die Proteine können sich wieder richtig falten. Das ist wichtig, damit sie durch einen Antikörper erkannt werden können.
      2. Um die unspezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern, wird die Membran mit Milchpulver oder bovinem Serumalbumin blockiert.
      3. Nach erneutem Waschen wird die Membran mit einem primären Antikörper gegen das zu detektierende Protein inkubiert. Der Antikörper bindet an die Proteine, die das von ihm erkannte Antigen enthalten.
      4. Waschen der Membran entfernt unspezifisch, d.h. nicht sehr fest, gebundene Antikörper.
      5. Als nächstes wird die Membran mit einem sekundären Antikörper inkubiert, der den Fc-Teil des primären Antikörper bindet. Der sekundäre Antikörper ist normalerweise entweder an ein Enzym gekoppelt (z.B. Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase) oder ist selber fluoreszenzmarkiert. Da mehrere sekundäre Antikörper an einen primären Antikörper binden können, gibt es eine Verstärkung des Signals im Gegensatz zur Markierung des primären Antikörpers.
      6. Nach einem weiteren Waschschritt wird der sekundäre Antikörper detektiert. Ist er enzymgekoppelt, löst die enzymatische Reaktion eine Farbreaktion aus oder erzeugt Chemilumineszenz, die z.B. mittels Röntgenfilm sichtbar gemacht werden kann. Auf der Membran gebundene, fluoreszenzmarkierte Antikörper werden in speziellen Scannern detektiert.
  • Beispiel: Borrelien-Serologie (Western-Blot-basierter Nachweis von Antikörpern gegen Borrelien bei Verdacht auf eine Infektion)
• ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
  • Prinzip: Ein Antigen wird auf einer festen Oberfläche immobilisiert und durch einen enzymgekoppelten Antikörper detektiert (direkter Nachweis). Im sog. Sandwich-ELISA wird ein Fängerantikörper auf eine feste Oberfläche gebunden, der das nachzuweisende Antigen bindet, das dann wiederum durch einen enzymgekoppelten Detektionsantikörper nachgewiesen werden kann.
  • Ergebnis: Nachweis und Quantifizierung von Antigenen (Proteinen, z.B. Antikörpern und Hormonen) in Gemischen
  • Vorgehen
    • Meistens werden Mikrotiterplatten (mit 96 Vertiefungen, sog. 96well-Platte) verwendet, deren Polystyrolböden mit einem entsprechenden Antikörper (oder bei direktem Nachweis auch mit Antigen) gecoated (bestückt) werden.
    • Wie beim Western Blot werden auch hier unspezifische Antikörperbindungen in den folgenden Schritten durch Blocken mit Milchpulver oder vergleichbaren Proteingemischen verhindert.
    • Nach einem Waschschritt wird die gecoatete Platte mit der Probe inkubiert, d.h. die Probe wird auf die vorbereitete Platte aufgebracht. In diesem Schritt bindet das Protein, das von dem auf der Platte gebundenen Antikörper erkannt wird, an diesen Antikörper und wird dadurch festgehalten.
    • Durch Zugabe des Detektionsantikörpers wird das gebundene Protein detektiert. Der Detektionsantikörper ist dabei (wie z.T. auch beim Western Blot) an ein Enzym gekoppelt (daher der Name ELISA).
    • Ein passendes Substrat wird zugesetzt, sodass das Enzym das Substrat umsetzen kann. Das entstehende Signal wird dann per Farbreaktion oder durch Emittieren von Fluoreszenz oder Lumineszenz detektiert. Die Intensität des Signals ist proportional zur Proteinmenge.
  • Beispiele: Schwangerschaftstest (Nachweis von humanem Choriongonadotropin), Anti-HIV-Antikörper-Suchtest

Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung und -sequenz

Oft möchte man wissen, aus welchen Aminosäuren ein Protein zusammengesetzt ist bzw. wie seine Aminosäuresequenz lautet. Es lassen sich so Proteine vergleichen und Mutationen nachweisen. Folgende Methoden kommen hier zum Einsatz:

• Analyse der Aminosäurezusammensetzung mittels Ninhydrinreaktion
  1. Hydrolyse des Proteins durch Säurezusatz
  2. Trennung der Aminosäuren durch Ionenaustauschchromatografie
  3. Ermittlung der Konzentration durch die Ninhydrinreaktion
     • Ninhydrin reagiert mit den primären Aminogruppen der Aminosäuren zu einem blau-violetten Farbstoff, wobei die Farbintensität der Konzentration an Aminosäuren entspricht
• Analyse der Aminosäuresequenz: Mithilfe des Edman-Abbaus
  1. Markierung der Aminosäure am N-Terminus
  2. Abspaltung und Bestimmung dieser Aminosäure durch die Eigenschaften ihrer Seitenkette

Molekularbiologische Methoden

Wozu dient die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)?

Beschreibe den Ablauf eines PCR-Amplifikationszyklus! Wie oft wird dieser in etwa wiederholt?

Was versteht man in der Molekularbiologie unter Hybridisierung? Nenne Beispiele für darauf basierende Labormethoden!

Wozu dienen sog. Agarplatten?

Wie wird bei der Klonierung ein DNA-Abschnitt in einen Vektor eingebaut?

Proteinanalytik

Ninhydrin wird für den Nachweis von Aminosäuren sowie für die Bestimmung der Konzentration von Aminosäuren innerhalb eines Proteins verwendet. Mit welcher funktionellen Gruppe reagiert Ninhydrin und was entsteht dabei?

Nach welchen Eigenschaften werden Proteingemische in den folgenden biochemischen Verfahren jeweils aufgetrennt: Ionenaustausch-Chromatografie, Affinitätschromatografie, Gelfiltrationschromatografie?

Eine Sammlung von allgemeineren und offeneren Fragen zu den verschiedenen prüfungsrelevanten Themen findest du im Kapitel Beispielfragen aus dem mündlichen Physikum.